实验前准备

实验材料：选取健康小鼠或人体新鲜肠道组织，应尽可能在获取组织后立即开展实验，以保证组织活性。

实验试剂与耗材：准备基础培养基、胎牛血清、多种细胞因子（如 EGF、Noggin、R - Spondin 1 等）、基质胶、胰蛋白酶、EDTA、青霉素 - 链霉素双抗、离心管、培养皿、移液器及枪头、细胞培养板等。上述试剂均需保证无菌，耗材需经过灭菌处理。

实验设备：确保超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、显微镜等设备处于正常运行状态，且超净工作台需提前开启紫外灯进行消毒。

组织处理

清洗与剪碎：将获取的肠道组织置于含冰冷 PBS 缓冲液的培养皿中，仔细清洗以去除肠道内容物。随后，用眼科剪将组织剪成 1 - 2 毫米的小段。

消化处理：把剪碎的组织转移至离心管，加入含 0.5 mM EDTA 的 PBS 溶液，置于 37℃恒温摇床，以 150 - 200 转 / 分钟的速度振荡消化 30 - 40 分钟 。消化结束后，通过轻柔吹打使组织进一步分散，接着进行低速离心，如 1000 转 / 分钟，离心 5 分钟，弃去上清液。

类器官培养

基质胶包被：在 24 孔细胞培养板中，每孔加入 50 - 100 μl 基质胶，确保基质胶均匀覆盖孔底，将培养板置于 37℃培养箱中孵育 30 - 60 分钟，使基质胶凝固。

细胞重悬与接种：向装有处理后组织的离心管中加入含 10% 胎牛血清、1% 双抗以及多种细胞因子的基础培养基，轻柔吹打形成单细胞悬液。将细胞悬液与融化的基质胶按 1:1 - 1:3 的体积比混合均匀，随后接种到已包被基质胶的 24 孔板中，每孔接种 100 - 150 μl 混合液。

培养与观察：将培养板再次放入 37℃、5% CO₂的培养箱中孵育 30 - 60 分钟，待基质胶完全凝固后，缓慢加入适量的类器官生长培养基。每隔 2 - 3 天进行换液，及时去除代谢废物并补充营养物质。在倒置显微镜下定期观察类器官的生长状态，通常 3 - 5 天可观察到明显的类器官形成。

类器官传代

消化处理：当类器官生长至一定大小（通常为直径 100 - 200 微米）且数量较多时，需进行传代。吸去培养孔中的培养基，用 PBS 轻轻冲洗 2 - 3 次，加入适量胰蛋白酶 - EDTA 消化液，37℃孵育 3 - 5 分钟。在显微镜下观察，当类器官开始离散时，加入含血清的培养基终止消化。

细胞重悬与接种：通过轻柔吹打使类器官完全分散成单细胞或小细胞团，随后进行离心收集细胞。弃去上清液，加入适量新鲜基质胶与培养基的混合液，重悬细胞并接种到新的包被好基质胶的培养孔中，按照上述培养条件继续培养 。

在整个类器官培养过程中，必须严格遵守无菌操作原则，防止微生物污染，确保类器官正常生长。 不同来源的类器官（如肝脏、肾脏、肺等）在培养操作上可能存在差异，应根据具体情况进行适当调整。